电影《御姐在上》讲述了屌丝吴岩在一次酒吧夜生活中被女郎MiMi灌醉，进而误陷圈套，进入了集团大小姐唐琪的房间的故事。吴岩原本只是想在酒吧逍遥地撩妹，却没有料到会卷入这场令人匪夷所思的事件

在唐琪的房间里，吴岩酒醉欲上前动手动脚，却被唐琪玩弄于股掌之间。随后的一系列误会和情节发展，让这个普通的屌丝和高贵的大小姐之间的故事变得扑朔迷离。唐琪和她的哥哥在一次再次前往酒吧时，恰巧坐在吴岩和他的朋友三哥旁边。他们听到吴岩对他的朋友解释昨晚被揍的“真相”，谎称与MiMi因为激情受伤，唐琪不禁感到震惊和困惑。

随后，唐琪决定假扮成吴岩的女朋友，以躲避仇家的追杀。她威胁吴岩必须带她回家，并且将他卷入了一系列荒诞的情节之中。吴岩希望通过一场英雄救美的表演来赢得大小姐的芳心，但他没想到唐琪早已识破了他的伎俩。

尽管两人曾经是朝夕相处的朋友，但在一系列误会和情感的纠葛中，他们暗生情愫。然而，当唐琪的仇家再次出现，吴岩为了保护她而受伤，这一切变得更加复杂。就在关键时刻，唐琪的哥哥出现，改变了整个局面。

随后，吴岩因头部受伤而失去了记忆，唐琪觉得这或许是一个新的开始。然而，她听从哥哥的安排，离开了吴岩。吴岩似乎忘记了唐琪的存在，但当他在酒吧泡妞的时候，突然收到了一个视频，视频中是唐琪抱着一个孩子。吴岩决定去找她们，寻找属于他们的答案和幸福。